2025/10/30 更新

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タカハシ　ヒデオ
高橋 栄夫
Hideo Takahashi
所属
生命医科学研究科 生命医科学専攻 教授
理学部 理学科
職名
教授
ホームページ
http://www-mls.tsurumi.yokohama-cu.ac.jp/fsb/takahashi/
プロフィール
1993年 東京大学大学院薬学系研究科博士課程修了、
日本学術振興会特別研究員、北里大学薬学部・助手、
東京大学薬学部・助手、産業技術総合研究所･主任研
究員を経て、2010年7月より現職
核磁気共鳴（NMR）法を主たる解析手法として、生体
高分子が関わる相互作用のメカニズムを多角的に明ら
かにし、新しい概念に基づく機能性分子設計のヒント
を得ていこうと考えています。物理化学・生化学・分
子生物学からタンパク質／ペプチド工学・ドラッグデ
ザインに至る幅広い領域に跨る研究を進めています。
外部リンク

学位

  • 博士（薬学） （ 東京大学 ）

研究キーワード

  • 生物物理化学

  • 核磁気共鳴

  • タンパク質

  • 構造生物学

研究分野

  • ライフサイエンス / 構造生物化学

経歴

  • 横浜市立大学 理学部／大学院生命医科学研究科生命医科学専攻   教授

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論文

  • Structural bases for the Charcot-Marie-Tooth disease induced by single amino acid substitutions of myelin protein zero. 国際誌

    Masayoshi Sakakura, Mikio Tanabe, Masaki Mori, Hideo Takahashi, Kazuhiro Mio

    Structure (London, England : 1993)   2023年8月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    Myelin protein zero (MPZ or P0) is a transmembrane protein which functions to glue membranes in peripheral myelin. Inter-membrane adhesion is mediated by homophilic interactions between the extracellular domains (ECDs) of MPZ. Single amino acid substitutions in an ECD cause demyelinating neuropathy, Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), with unknown mechanisms. In this study, by using a novel assay system "nanomyelin," we revealed that a stacked-rings-like ECD-8-mer is responsible for membrane adhesion. Two inter-ECD interactions, cis and head-to-head, are essential to constituting the 8-mer and to gluing the membranes. This result was reinforced by the observation that the CMT-related N87H substitution at the cis interface abolished membrane-adhesion activity. In contrast, the CMT-related D32G and E68V variants retained membrane-stacking activity, whereas their thermal stability was lower than that of the WT. Reduced thermal stability may lead to impairment of the long-term stability of ECD and the layered membranes of myelin.

    DOI： 10.1016/j.str.2023.08.016

    PubMed

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  • Nuclear Magnetic Resonance Detection of Hydrogen Bond Network in a Proton Pump Rhodopsin RxR and Its Alteration during the Cyclic Photoreaction 査読

    Rika Suzuki, Toshio Nagashima, Keiichi Kojima, Reika Hironishi, Masafumi Hirohata, Tetsuya Ueta, Takeshi Murata, Toshio Yamazaki, Yuki Sudo, Hideo Takahashi

    Journal of the American Chemical Society   145 ( 28 )   15295 - 15302   2023年7月

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    担当区分：責任著者   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：American Chemical Society (ACS)  

    DOI： 10.1021/jacs.3c02833

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  • Revisiting biomolecular NMR spectroscopy for promoting small-molecule drug discovery. 国際誌

    Hiroyuki Hanzawa, Takashi Shimada, Mizuki Takahashi, Hideo Takahashi

    Journal of biomolecular NMR   74 ( 10-11 )   501 - 508   2020年11月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    Recently, there has been increasing interest in new modalities such as therapeutic antibodies and gene therapy at a number of pharmaceutical companies. Moreover, in small-molecule drug discovery at such companies, efforts have focused on hard-to-drug targets such as inhibiting protein-protein interactions. Biomolecular NMR spectroscopy has been used in drug discovery in a variety of ways, such as for the reliable detection of binding and providing three-dimensional structural information for structure-based drug design. The advantages of using NMR spectroscopy have been known for decades (Jahnke in J Biomol NMR 39:87-90, (2007); Gossert and Jahnke in Prog Nucl Magn Reson Spectrosc 97:82-125, (2016)). For tackling hard-to-drug targets and increasing the success in discovering drug molecules, in-depth analysis of drug-target protein interactions performed by biophysical methods will be more and more essential. Here, we review the advantages of NMR spectroscopy as a key technology of biophysical methods and also discuss issues such as using cutting-edge NMR spectrometers and increasing the demand of utilizing conformational dynamics information for promoting small-molecule drug discovery.

    DOI： 10.1007/s10858-020-00314-0

    PubMed

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  • Cooperative interactions facilitate stimulation of Rad51 by the Swi5-Sfr1 auxiliary factor complex. 査読 国際誌

    Bilge Argunhan, Masayoshi Sakakura, Negar Afshar, Misato Kurihara, Kentaro Ito, Takahisa Maki, Shuji Kanamaru, Yasuto Murayama, Hideo Tsubouchi, Masayuki Takahashi, Hideo Takahashi, Hiroshi Iwasaki

    eLife   9   2020年3月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    Although Rad51 is the key protein in homologous recombination (HR), a major DNA double-strand break repair pathway, several auxiliary factors interact with Rad51 to promote productive HR. We present an interdisciplinary characterization of the interaction between Rad51 and Swi5-Sfr1, a conserved auxiliary factor. Two distinct sites within the intrinsically disordered N-terminus of Sfr1 (Sfr1N) were found to cooperatively bind Rad51. Deletion of this domain impaired Rad51 stimulation in vitro and rendered cells sensitive to DNA damage. By contrast, amino acid-substitution mutants, which had comparable biochemical defects, could promote DNA repair, suggesting that Sfr1N has another role in addition to Rad51 binding. Unexpectedly, the DNA repair observed in these mutants was dependent on Rad55-Rad57, another auxiliary factor complex hitherto thought to function independently of Swi5-Sfr1. When combined with the finding that they form a higher-order complex, our results imply that Swi5-Sfr1 and Rad55-Rad57 can collaboratively stimulate Rad51 in Schizosaccharomyces pombe.

    DOI： 10.7554/eLife.52566

    PubMed

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  • Structural Mechanisms Underlying Activity Changes in an AMPA-type Glutamate Receptor Induced by Substitutions in Its Ligand-Binding Domain 査読

    Masayoshi Sakakura, Yumi Ohkubo, Hiraku Oshima, Suyong Re, Masahiro Ito, Yuji Sugita, Hideo Takahashi

    STRUCTURE   27 ( 11 )   1698 - +   2019年10月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1016/j.str.2019.09.004

    Web of Science

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  • Rad51 Interaction Analysis Reveals a Functional Interplay Among Recombination Auxiliary Factors

    Bilge Argunhan, Masayoshi Sakakura, Negar Afshar, Misato Kurihara, Kentaro Ito, Takahisa Maki, Shuji Kanamaru, Yasuto Murayama, Hideo Tsubouchi, Masayuki Takahashi, Hideo Takahashi, Hiroshi Iwasaki

    2019年8月

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    出版者・発行元：Cold Spring Harbor Laboratory  

    ABSTRACT

    Although Rad51 is the key protein in homologous recombination (HR), a major DNA double-strand break repair pathway, several auxiliary factors interact with Rad51 to promote productive HR. Here, we present an interdisciplinary characterization of the interaction between Rad51 and Swi5-Sfr1, a widely conserved auxiliary factor. NMR and site-specific crosslinking experiments revealed two distinct sites within the intrinsically disordered N-terminus of Sfr1 that cooperatively bind to Rad51. Although disruption of this binding severely impaired Rad51 stimulation in vitro, interaction mutants did not show any defects in DNA repair. Unexpectedly, in the absence of the Rad51 paralogs Rad55-Rad57, which constitute another auxiliary factor complex, these interaction mutants were unable to promote DNA repair. Our findings provide molecular insights into Rad51 stimulation by Swi5-Sfr1 and suggest that, rather than functioning in an independent subpathway of HR as was previously proposed, Rad55-Rad57 facilitates the recruitment of Swi5-Sfr1 to Rad51.

    DOI： 10.1101/738179

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  • Population Shift Mechanism for Partial Agonism of AMPA Receptor. 査読

    Oshima H, Re S, Sakakura M, Takahashi H, Sugita Y

    Biophysical journal   116 ( 1 )   57 - 68   2019年1月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1016/j.bpj.2018.11.3122

    Web of Science

    PubMed

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  • Phosphoinositide binding by the PH domain in ceramide transfer protein (CERT) is inhibited by hyperphosphorylation of an adjacent serine-repeat motif 査読

    Sugiki, Toshihiko, Egawa, Daichi, Kumagai, Keigo, Kojima, Chojiro, Fujiwara, Toshimichi, Takeuchi, Koh, Shimada, Ichio, Hanada, Kentaro, Takahashi, Hideo

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   293 ( 28 )   11206 - 11217   2018年7月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.RA118.002465

    Web of Science

    PubMed

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  • Methyl-selective isotope labeling using α-ketoisovalerate for the yeast Pichia pastoris recombinant protein expression system. 査読

    Suzuki R, Sakakura M, Mori M, Fujii M, Akashi S, Takahashi H

    Journal of biomolecular NMR   71 ( 4 )   1 - 11   2018年6月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1007/s10858-018-0192-3

    Scopus

    PubMed

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  • Structural mechanisms for the S-nitrosylation-derived protection of mouse galectin-2 from oxidation-induced inactivation revealed by NMR. 査読

    Sakakura M, Tamura M, Takeuchi T, Hatanaka T, Arata Y, Takahashi H

    The FEBS journal   285 ( 6 )   1129 - 1145   2018年3月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1111/febs.14397

    PubMed

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    その他リンク： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1111/febs.14397

  • Allosteric activation of membrane-bound glutamate receptors using coordination chemistry within living cells 査読

    Shigeki Kiyonaka, Ryou Kubota, Yukiko Michibata, Masayoshi Sakakura, Hideo Takahashi, Tomohiro Numata, Ryuji Inoue, Michisuke Yuzaki, Itaru Hamachi

    NATURE CHEMISTRY   8 ( 10 )   958 - 967   2016年10月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1038/NCHEM.2554

    Web of Science

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  • Suppression of Problematic Compound Oligomerization by Cosolubilization of Nondetergent Sulfobetaines 査読

    Yumiko Mizukoshi, Koh Takeuchi, Misa Arutaki, Takeshi Takizawa, Hiroyuki Hanzawa, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    CHEMMEDCHEM   10 ( 4 )   736 - 741   2015年4月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1002/cmdc.201500057

    Web of Science

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  • Dynamic multidrug recognition by multidrug transcriptional repressor LmrR 査読

    Koh Takeuchi, Yuji Tokunaga, Misaki Imai, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    SCIENTIFIC REPORTS   4   2014年11月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1038/srep06922

    Web of Science

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  • Allosteric enhancement of MAP kinase p38 alpha's activity and substrate selectivity by docking interactions 査読

    Yuji Tokunaga, Koh Takeuchi, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    NATURE STRUCTURAL & MOLECULAR BIOLOGY   21 ( 8 )   704 - 711   2014年8月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1038/nsmb.2861

    Web of Science

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  • Structure-Based Approach To Improve a Small-Molecule Inhibitor by the Use of a Competitive Peptide Ligand 査読

    Katsuki Ono, Koh Takeuchi, Hiroshi Ueda, Yasuhiro Morita, Ryuji Tanimura, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION   53 ( 10 )   2597 - 2601   2014年3月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1002/anie.201310749

    Web of Science

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  • Dual-phospholyrated apo Human p38 alpha ILVM methyl resonance assignments 査読

    Tokunaga Yuji, Takeuchi Koh, Takahashi Hideo, Shimada Ichio

    Biological Magnetic Resonance Data Bank   2014年

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  • Rapid Identification of Ligand-Binding Sites by Using an Assignment-Free NMR Approach 査読

    Yuya Kodama, Koh Takeuchi, Nobuhisa Shimba, Kohki Ishikawa, Ei-ichiro Suzuki, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY   56 ( 22 )   9342 - 9350   2013年11月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/jm4014357

    Web of Science

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  • Perdeuteration and methyl-selective H-1, C-13-labeling by using a Kluyveromyces lactis expression system 査読

    Mayumi Miyazawa-Onami, Koh Takeuchi, Toshiaki Takano, Toshihiko Sugiki, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    JOURNAL OF BIOMOLECULAR NMR   57 ( 3 )   297 - 304   2013年11月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1007/s10858-013-9789-8

    Web of Science

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  • NMRでリガンド分子の活性部位を探索する 招待

    高橋 栄夫

    化学   68 ( 5 )   39 - 43   2013年

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    記述言語：日本語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：化学同人  

    CiNii Books

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  • Structural Basis for the Golgi Association by the Pleckstrin Homology Domain of the Ceramide Trafficking Protein (CERT) 査読

    Toshihiko Sugiki, Koh Takeuchi, Toshiyuki Yamaji, Toshiaki Takano, Yuji Tokunaga, Keigo Kumagai, Kentaro Hanada, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   287 ( 40 )   33706 - 33718   2012年9月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.M112.367730

    Web of Science

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  • NMR study of ligand release from asialoglycoprotein receptor under solution conditions in early endosomes 査読

    Takuo Onizuka, Hiroyuki Shimizu, Yuka Moriwaki, Takayuki Nakano, Shozo Kanai, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    FEBS JOURNAL   279 ( 15 )   2645 - 2656   2012年8月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1111/j.1742-4658.2012.08643.x

    Web of Science

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  • Isotopic labeling of heterologous proteins in the yeast Pichia pastoris and Kluyveromyces lactis. 査読

    Sugiki T, Ichikawa O, Miyazawa-Onami M, Shimada I, Takahashi H

    Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)   831   19 - 36   2012年

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    担当区分：責任著者  

    DOI： 10.1007/978-1-61779-480-3_2

    PubMed

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  • 2RSG: Solution structure of the CERT PH domain 査読

    Sugiki T, Takeuchi K, Tokunaga Y, Kumagai K, Kawano M, Nishijima M, Hanada K, Takahashi H, Shimada I

    Worldwide Protein Data Bank   2012年

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  • An Accurate Pharmacophore Mapping Method by NMR Spectroscopy 査読

    Yumiko Mizukoshi, Aya Abe, Takeshi Takizawa, Hiroyuki Hanzawa, Yoshifumi Fukunishi, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION   51 ( 6 )   1362 - 1365   2012年

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1002/anie.201104905

    Web of Science

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  • Affinity transfer to a human protein by CDR3 grafting of camelid VHH 査読

    Hidetoshi Inoue, Akiko Ilhara, Hideo Takahashi, Ichio Shimada, Isao Ishida, Yoshitake Maeda

    PROTEIN SCIENCE   20 ( 12 )   1971 - 1981   2011年12月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1002/pro.734

    Web of Science

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  • Protein-ligand docking guided by ligand pharmacophore-mapping experiment by NMR. 査読

    Fukunishi Y, Mizukoshi Y, Takeuchi K, Shimada I, Takahashi H, Nakamura H

    Journal of molecular graphics & modelling   31   20 - 27   2011年11月

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  • Rapid identification of protein-protein interfaces for the construction of a complex model based on multiple unassigned signals by using time-sharing NMR measurements 査読

    Yuya Kodama, Michael L. Reese, Nobuhisa Shimba, Katsuki Ono, Eiji Kanamori, Volker Doetsch, Shuji Noguchi, Yoshifumi Fukunishi, Ei-ichiro Suzuki, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY   174 ( 3 )   434 - 442   2011年6月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1016/j.jsb.2011.04.001

    Web of Science

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  • HNCA-TOCSY-CANH experiments with alternate (13)C- (12)C labeling: a set of 3D experiment with unique supra-sequential information for mainchain resonance assignment. 査読

    Takeuchi K, Gal M, Takahashi H, Shimada I, Wagner G

    Journal of biomolecular NMR   49 ( 1 )   17 - 26   2011年1月

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  • Precise structural determination of weakly binding peptides by utilizing dihedral angle constraints. 査読

    Mizukoshi Y, Nagasu M, Shimada I, Takahashi H

    Journal of biomolecular NMR   46 ( 4 )   299 - 305   2010年4月

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  • Real-time assay method of lipid extraction activity. 査読

    Sugiki T, Takahashi H, Nagasu M, Hanada K, Shimada I

    Analytical biochemistry   399   162 - 167   2010年4月

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    担当区分：責任著者   出版者・発行元：2  

    DOI： 10.1016/j.ab.2009.12.031

    PubMed

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  • Direct Determination of the Insulin-Insulin Receptor Interface Using Transferred Cross-Saturation Experiments 査読

    Takefumi Nakamura, Hideo Takahashi, Mitsuo Takahashi, Nobuhisa Shimba, Ei-ichiro Suzuki, Ichio Shimada

    JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY   53 ( 5 )   1917 - 1922   2010年3月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/jm901099v

    Web of Science

    PubMed

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  • Structural Basis for Platelet Antiaggregation by Angiotensin II Type 1 Receptor Antagonist Losartan (DuP-753) via Glycoprotein VI 査読

    Katsuki Ono, Hiroshi Ueda, Yoshitaka Yoshizawa, Daisuke Akazawa, Ryuji Tanimura, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY   53 ( 5 )   2087 - 2093   2010年3月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/jm901534d

    Web of Science

    PubMed

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  • Production of isotopically labeled heterologous proteins in non-E. coli prokaryotic and eukaryotic cells. 査読

    Takahashi H, Shimada I

    Journal of biomolecular NMR   46 ( 1 )   3 - 10   2010年1月

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    担当区分：筆頭著者,　責任著者  

    DOI： 10.1007/s10858-009-9377-0

    Web of Science

    PubMed

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  • Structural basis of the interaction between chemokine stromal cell-derived factor-1/CXCL12 and its G-protein-coupled receptor CXCR4 査読

    Yutaka Kofuku, Chie Yoshiura, Takumi Ueda, Hiroaki Terasawa, Takahiro Hirai, Sae Tominaga, Masako Hirose, Yoshitake Maeda, Hideo Takahashi, Yuya Terashima, Kouji Matsushima, Ichio Shimada

    Journal of Biological Chemistry   284 ( 50 )   35240 - 35250   2009年12月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.M109.024851

    Scopus

    PubMed

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  • Structural investigation of the interaction between LolA and LolB using NMR. 査読

    Nakada S, Sakakura M, Takahashi H, Okuda S, Tokuda H, Shimada I

    The Journal of biological chemistry   284 ( 36 )   24634 - 24643   2009年9月

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  • High-throughput screening of optimal solution conditions for structural biological studies by fluorescence correlation spectroscopy. 査読 国際誌

    Sugiki T, Yoshiura C, Kofuku Y, Ueda T, Shimada I, Takahashi H

    Protein science : a publication of the Protein Society   18 ( 5 )   1115 - 1120   2009年5月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：5  

    DOI： 10.1002/pro.92

    PubMed

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  • Structural and Interaction Analysis of Glycoprotein VI-binding Peptide Selected from a Phage Display Library 査読

    Kozue Kato-Takagaki, Yumiko Mizukoshi, Yoshitaka Yoshizawa, Daisuke Akazawa, Yuichi Torii, Katsuki Ono, Ryuji Tanimura, Ichio Shimada, Hideo Takahashi

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   284 ( 16 )   10720 - 10727   2009年4月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.M808563200

    Web of Science

    PubMed

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  • Cross-saturation and transferred cross-saturation experiments 査読

    Shimada Ichio, Ueda Takumi, Matsumoto Masahiko, Sakakura Masayoshi, Osawa Masanori, Takeuchi Koh, Nishida Noritaka, Takahashi Hideo

    PROGRESS IN NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY   54 ( 2 )   123 - 140   2009年2月

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  • Stable isotope labeling of protein by Kluyveromyces lactis for NMR study. 査読

    Sugiki T, Shimada I, Takahashi H

    Journal of biomolecular NMR   42   159 - 162   2008年11月

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    担当区分：責任著者   出版者・発行元：3  

    DOI： 10.1007/s10858-008-9276-9

    PubMed

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  • [NMR analysis of ligand molecules that weakly bind to target molecules]. 査読

    Takahashi H, Shimada I

    Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, nucleic acid, enzyme   52 ( 9 )   959 - 965   2007年8月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：共立出版  

    PubMed

    CiNii Books

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  • Backbone resonance assignments for the periplasmic chaperone LolA from Escherichia coli. 査読

    Nakada S, Takahashi H, Sakakura M, Kurono M, Shimada I

    Biomolecular NMR assignments   1 ( 1 )   125 - 127   2007年7月

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  • Backbone resonance assignment for the outer membrane lipoprotein receptor LolB from Escherichia coli. 査読

    Nakada S, Sakakura M, Takahashi H, Tokuda H, Shimada I

    Biomolecular NMR assignments   1 ( 1 )   121 - 123   2007年7月

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  • Identification and characterization of the slowly exchanging pH-dependent conformational rearrangement in KcsA. 査読

    Takeuchi K, Takahashi H, Kawano S, Shimada I

    The Journal of biological chemistry   282 ( 20 )   15179 - 15186   2007年5月

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  • Structural basis of the transition-state stabilization in antibody-catalyzed hydrolysis. 査読

    Sakakura M, Takahashi H, Shimba N, Fujii I, Shimada I

    Journal of molecular biology   367 ( 1 )   133 - 147   2007年3月

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  • Pairwise NMR experiments for the determination of protein backbone dihedral angle Phi based on cross-correlated spin relaxation. 査読

    Takahashi H, Shimada I

    Journal of biomolecular NMR   37 ( 3 )   179 - 185   2007年3月

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    担当区分：筆頭著者,　責任著者  

    DOI： 10.1007/s10858-006-9108-8

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  • 磁気共鳴分光 : III. 緩和

    高橋 栄夫

    分光研究 = Journal of the spectroscopical research of Japan   55 ( 3 )   205 - 220   2006年6月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：The Spectroscopical Society of Japan  

    Nuclear spin relaxation is one of the fundamental aspects of Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Transverse relaxation rate governs the linewidth of the resonance, and longitudinal relaxton rate affects the determination of the recycle delay for each acquisition. On the other hand, cross-relaxation causes the nuclear Overhauser effect (NOE) which gives us distance information used for the 3D structure determination of molecules. Recently, crosscorrelated relaxation has been effectively utilized to develop novel NMR mesaurements. In this review, semi-classical treatment of relaxation theory is briefly intuoduced, and by utilizing the derived double commutator operation, various aspects of nuclear spin relaxation are investigated in terms of molecular motions.

    DOI： 10.5111/bunkou.55.205

    CiNii Books

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    その他リンク： https://jlc.jst.go.jp/DN/JALC/00281621765?from=CiNii

  • Utilization of methyl proton resonances in cross-saturation measurement for determining the interfaces of large protein-protein complexes 査読

    Hideo Takahashi, Mayumi Miyazawa, Yasuo Ina, Yoshifumi Fukunishi, Yumiko Mizukoshi, Haruki Nakamura, Ichio Shimada

    Journal of Biomolecular NMR   34 ( 3 )   167 - 177   2006年3月

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    担当区分：筆頭著者,　責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1007/s10858-006-0008-8

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  • Rapid preparation of stable isotope labeled peptides that bind to target proteins by a phage library system. 査読

    Mizukoshi Y, Takahashi H, Shimada I

    Journal of biomolecular NMR   34 ( 1 )   23 - 30   2006年1月

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    担当区分：責任著者  

    DOI： 10.1007/s10858-005-5054-0

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  • Backbone resonance assignments for the Fv fragment of catalytic antibody 6D9 complexed with a transition state analogue. 査読

    Sakakura M, Takahashi H, Terasawa H, Takeuchi K, Fujii I, Shimada I

    Journal of biomolecular NMR   33 ( 4 )   282   2005年12月

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  • Direct determination of a membrane-peptide interface using the nuclear magnetic resonance cross-saturation method 査読

    Takefumi Nakamura, Hideo Takahashi, Koh Takeuchi, Toshiyuki Kohno, Kaori Wakamatsu, Ichio Shimada

    Biophysical Journal   89 ( 6 )   4051 - 4055   2005年

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：Biophysical Society  

    DOI： 10.1529/biophysj.105.066910

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  • Channel-forming membrane permeabilization by an antibacterial protein, sapecin. Determination of membrane-buried and oligomerization surfaces by NMR 査読

    Koh Takeuchi, Hideo Takahashi, Mariko Sugai, Hideo Iwai, Toshiyuki Kohno, Kazuhisa Sekimizu, Shunji Natori, Ichio Shimada

    Journal of Biological Chemistry   279 ( 6 )   4981 - 4987   2004年2月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.M307815200

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  • Molecular basis of the high-affinity activation of type 1 ryanodine receptors by imperatoxin A. 査読

    Lee CW, Lee EH, Takeuchi K, Takahashi H, Shimada I, Sato K, Shin SY, Kim DH, Kim JI

    The Biochemical journal   377 ( Pt 2 )   385 - 394   2004年1月

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  • Collagen-binding mode of vWF-A3 domain determined by a transferred cross-saturation experiment. 査読

    Nishida N, Sumikawa H, Sakakura M, Shimba N, Takahashi H, Terasawa H, Suzuki E, Shimada I

    Nature structural biology   10 ( 1 )   53 - 58   2003年1月

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  • Structural basis of the KcsA K+ channel and agitoxin2 pore-blocking toxin interaction by using the transferred cross-saturation method 査読

    Koh Takeuchi, Mariko Yokogawa, Tomoki Matsuda, Mariko Sugai, Seiko Kawano, Toshiyuki Kohno, Haruki Nakamura, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    Structure   11 ( 11 )   1381 - 1392   2003年

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：Cell Press  

    DOI： 10.1016/j.str.2003.10.003

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  • 交差飽和法による生体超分子複合体の相互作用解析

    高橋 栄夫

    生物物理   43   S21   2003年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人 日本生物物理学会  

    DOI： 10.2142/biophys.43.S21_1

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  • Backbone 1H, 13C, and 15N resonance assignments of the von Willebrand factor A3 domain. 査読

    Nishida N, Miyazawa M, Sumikawa H, Sakakura M, Shimba N, Takahashi H, Terasawa H, Suzuki E, Shimada I

    Journal of biomolecular NMR   24 ( 4 )   357 - 358   2002年12月

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  • Solution structure of omega-grammotoxin SIA, a gating modifier of P/Q and N-type Ca(2+) channel. 査読

    Takeuchi K, Park E, Lee C, Kim J, Takahashi H, Swartz K, Shimada I

    Journal of molecular biology   321 ( 3 )   517 - 526   2002年8月

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  • Determination of the interface of a large protein complex by transferred cross-saturation measurements. 査読

    Nakanishi T, Miyazawa M, Sakakura M, Terasawa H, Takahashi H, Shimada I

    Journal of molecular biology   318 ( 2 )   245 - 249   2002年4月

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  • Identification and characterization of an antibacterial peptide of the 26-kDa protease of Sarcophaga peregrina with antibacterial activity. 査読

    Tsuji Y, Aoyama T, Takeuchi K, Homma Ki, Takahashi H, Nakajima Y, Shimada I, Natori S

    Journal of biochemistry   130 ( 2 )   313 - 318   2001年8月

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    記述言語：英語   出版者・発行元：2  

    Previously, we purified a serine protease with a molecular mass of 26 kDa that exhibits potent antibacterial activity from a pupal extract of <i>Sarcophaga peregrina</i> (flesh fly). We divided this protease into 12 peptides and examined their antibacterial activity. A peptide corresponding to residues 155 to 174 (peptide 9) was found to exhibit antibacterial activity comparable to that of the 26-kDa protease. When <i>Escherichia coli</i> was treated with peptide 9, the permeability of both the outer and inner membranes increased, and substrates for β-lactamase and β-galactosidase entered the cells, but β-galactosidase did not leak out of the cells under these conditions. It was suggested that residues 6 to 18 of peptide 9 form an amphiphilic α-helix under hydrophobic conditions with an N-terminal basic loop and then interact with acidic phospholipids in the bacterial membranes.

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  • Solution structure of micelle-bound H5 peptide (427-452): a primary structure corresponding to the pore forming region of the voltage dependent potassium channel 査読

    K Shindo, H Takahashi, K Shinozaki, K Kami, K Anzai, S Lee, H Aoyagi, Y Kirino, Shimada, I

    BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEIN STRUCTURE AND MOLECULAR ENZYMOLOGY   1545 ( 1-2 )   153 - 159   2001年2月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1016/s0167-4838(00)00273-9

    Web of Science

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  • Solution structure of hanatoxin1, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: Common surface features of gating modifier toxins 査読

    Hideo Takahashi, Jae Il Kim, Hye Jung Min, Kazuki Sato, Kenton J. Swartz, Ichio Shimada

    Journal of Molecular Biology   297 ( 3 )   771 - 780   2000年3月

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    担当区分：筆頭著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：Academic Press  

    DOI： 10.1006/jmbi.2000.3609

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  • A novel NMR method for determining the interfaces of large protein- protein complexes 査読

    Hideo Takahashi, Tamiji Nakanishi, Keiichiro Kami, Yoji Arata, Ichio Shimada

    Nature Structural Biology   7 ( 3 )   220 - 223   2000年3月

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    担当区分：筆頭著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1038/73331

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  • The pH-dependent structural variation of complementarity-determining region H3 in the crystal structures of the Fv fragment from an anti-dansyl monoclonal antibody 査読

    Masayoshi Nakasako, Hideo Takahashi, Nobuhisa Shimba, Ichio Shimada, Yoji Arata

    Journal of Molecular Biology   291 ( 1 )   117 - 134   1999年9月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）   出版者・発行元：Academic Press  

    DOI： 10.1006/jmbi.1999.2931

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  • A multinuclear NMR study of the active site of an endoglucanase from a strain of Bacillus: Use of Trp residues as structural probes 査読

    Shunro Kawaminami, Hideo Takahashi, Susumu Ito, Yoji Arata, Ichio Shimada

    Journal of Biological Chemistry   274 ( 28 )   19823 - 19828   1999年7月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1074/jbc.274.28.19823

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  • Three-dimensional Solution Structure of Calcium Channel Activator: Imperatoxin A Detrermined by NMR Spectroscopy 査読

    Koh Takeuchi, Jae Il Kim, Hideo Takahashi, Kazuki Sato, Ichio Shimada

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   1999   307 - 310   1999年

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    記述言語：英語  

    CiNii Books

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  • Determination of protonation, deprotonation forms and tautomeric states of histidine residues in large proteins by using nitrogen-carbon J couplings in imidazole ring 査読

    Shimba N, Takahashi H, Sakakura M, Fujii I, Shimada I

    Journal of the American Chemical Society   120 ( 42 )   10988 - 10989   1998年10月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/ja982153g

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  • NMR study of the interaction between the B domain of staphylococcal protein A and the Fc portion of immunoglobulin G 査読

    Hiroaki Gouda, Miki Shiraishi, Hideo Takahashi, Koichi Kato, Hidetaka Torigoe, Yoji Arata, Ichio Shimada

    Biochemistry   37 ( 1 )   129 - 136   1998年1月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/bi970923f

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  • Comparative thermodynamic analyses of the Fv, Fab* and Fab and Fab fragments of anti-dansyl mouse monoclonal antibody 査読

    Nobuhisa Shimba, Hidetaka Torigoe, Hideo Takahashi, Katsuyoshi Masuda, Ichio Shimada, Yoji Arata, Akinori Sarai

    FEBS Letters   360 ( 3 )   247 - 250   1995年3月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1016/0014-5793(95)00113-N

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  • NMR Study of Antibody: A Multinuclear NMR Approach 査読

    Yoji Arata, Koichi Kato, Hideo Takahashi, Ichio Shimada

    Method. Enzymol.   239   440 - 464   1994年

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  • Dynamical Structure of the Antibody Combining Site as Studied by 1H-15N Shift Correlation NMR Spectroscopy 査読

    Hideo Takahashi, Ichio Shimada, Yoji Arata, Erika Suzuki

    Biochemistry   31 ( 9 )   2464 - 2468   1992年2月

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    担当区分：責任著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/bi00124a005

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  • Isotope-Edited Nuclear Magnetic Resonance Study of Fv Fragment of Anti-Dansyl Mouse Monoclonal Antibody: Recognition of the Dansyl Hapten 査読

    Asano Odaka, Jae Il Kim, Hideo Takahashi, Ichio Shimada, Yoji Arata

    Biochemistry   31 ( 44 )   10686 - 10691   1992年2月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/bi00159a007

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  • Multinuclear NMR Study of the Structure of the Fv Fragment of Anti-Dansyl Mouse IgG2a Antibody 査読

    Hideo Takahashi, Asano Odaka, Chigusa Matsunaga, Koichi Kato, Ichio Shimada, Yoji Arata, Shunro Kawaminami

    Biochemistry   30 ( 26 )   6611 - 6619   1991年7月

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    担当区分：筆頭著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/bi00240a034

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  • Preparation of the Fv Fragment from a Short-Chain Mouse IgG2a Anti-Dansyl Monoclonal Antibody and Use of Selectively Deuterated Fv Analogues for Two-Dimensional 1H NMR Analyses of the Antigen-Antibody Interactions 査読

    Hideo Takahashi, Takako Igarashi, Ichio Shimada, Yoji Arata

    Biochemistry   30 ( 11 )   2840 - 2847   1991年3月

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    担当区分：筆頭著者   記述言語：英語   掲載種別：研究論文（学術雑誌）  

    DOI： 10.1021/bi00225a016

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  • 特集 タンパク質の構造形成と機能 ＮＭＲからみたタンパク質の機能性構造の動的特性

    高橋 栄夫, 荒田 洋治

    高分子   40 ( 9 )   628 - 631   1991年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：The Society of Polymer Science, Japan  

    DOI： 10.1295/kobunshi.40.628

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    その他リンク： https://jlc.jst.go.jp/DN/JALC/00077880512?from=CiNii

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書籍等出版物

  • 先端の分析法 第2版

    高橋 栄夫（ 担当： 共著 範囲: 第2章 ２. 多次元NMR測定）

    エヌ・ティー・エス  2022年1月  （ ISBN:9784860437374 ）

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    総ページ数：5, 13, 973, 18p, 図版56p   記述言語：日本語  

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  • NMRによる有機材料分析とその試料前処理、データ解釈

    坂倉 正義, 高橋 栄夫（ 担当： 共著 範囲: 第6章 第5節 NMRによるペプチドの立体構造解析）

    技術情報協会  2021年9月  （ ISBN:9784861048609 ）

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    総ページ数：676p   記述言語：日本語  

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  • バイオサイエンスのための物理化学 第5版

    高橋 栄夫（ 担当： 共訳 範囲: 第14章 磁気共鳴、付録1 数学）

    東京化学同人  2015年6月 

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  • 生体有機化学

    高橋 栄夫, 嶋田 一夫（ 担当： 共著 範囲: 第7章：タンパク質と生体小分子の相互作用２）

    東京化学同人  2012年 

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  • Methods in Molecular Biology 831

    （ 担当： 共著 範囲: Chapter 2: Isotopic labeling of heterologous proteins in the yeast Pichia pastoris and Kluyveromyces lactis）

    Humana Press  2012年 

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MISC

  • ポンプ機能変換を目指したプロトンポンプ型ロドプシンRxR改変体の解析

    阿部優介, 穂谷野知佳, 廣西麗加, 廣畑雅史, 鈴木里佳, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   47th   2024年

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  • 溶液NMR法を用いた光駆動ロドプシンRxRのプロトン放出メカニズムの解析

    廣西麗加, 長島敏夫, 鈴木里佳, 廣畑雅史, 小島慧一, 山崎俊夫, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   47th   2024年

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  • 異なる膜様環境下でのプロトンポンプ型ロドプシンRxRの構造および熱安定性の比較解析

    菊間千滉, 鈴木里佳, 徳永裕二, 竹内恒, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   47th   2024年

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  • 光照射溶液NMR技術を用いたプロトンポンプ型ロドプシンR×Rの暗状態および光反応サイクル中間体における構造特性解析

    鈴木里佳, 廣西麗加, 小島慧一, 須藤雄気, 長島敏雄, 山崎俊夫, 高橋栄夫

    Abstracts. Annual Meeting of the NMR Society of Japan   61st   2022年

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  • 光照射溶液NMR法によるプロトンポンプ型ロドプシンRxRの光反応サイクル後期中間体の局所構造解析

    廣西麗加, 鈴木里佳, 小島慧一, 須藤雄気, 長島敏雄, 山崎俊夫, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   45th   2022年

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  • 溶液NMR法を用いたプロトンポンプ型ロドプシンTRとカロテノイドの相互作用解析

    穂谷野知佳, 鈴木里佳, 廣畑雅史, 村田武士, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   45th   2022年

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  • 異なる膜環境におけるプロトンポンプ型ロドプシンRxRの熱安定性,構造および光反応サイクルの比較解析

    菊間千滉, 鈴木里佳, 藤田陽, 廣畑雅史, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   45th   2022年

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  • 神経栄養因子NGF高親和性受容体TrkAドメイン5と新規結合ペプチドの相互作用解析

    鈴木里佳, 登坂綺水, 浴本亨, 高橋真帆, 山根努, 坂倉正義, 水越弓子, 竹内恒, 嶋田一夫, 池口満徳, 池口満徳, 高橋栄夫

    日本薬学会年会要旨集(Web)   141st   2021年

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  • 異なる膜様環境下におけるプロトンポンプ型ロドプシンRxRの機能および構造変化の解析

    廣畑雅史, 鈴木里佳, 穗谷野知佳, 藤田陽, 吉田真帆子, 村田武士, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   44th   2021年

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  • 溶液NMRを用いた微生物型プロトンポンプ型ロドプシンRxRの機能・構造解析

    廣畑雅史, 鈴木里佳, 小島慧一, 吉田真帆子, 村田武士, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   43rd   2020年

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  • ガレクチン-2のS-ニトロソ化部位のLC-MS/MSによる解析

    田村 真由美, 藤井 智彦, 坂倉 正義, 武内 智春, 畑中 朋美, 高橋 栄夫, 岸本 成史, 荒田 洋一郎

    日本薬学会年会要旨集   139年会 ( 3 )   102 - 102   2019年3月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：(公社)日本薬学会  

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  • 異なる疑似膜環境中における耐熱性膜タンパク質RxRの構造安定性と機能の解析

    吉田真帆子, 鈴木里佳, 廣畑雅史, 村田武士, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   42nd   2019年

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  • 溶液NMR法を用いた界面活性剤ミセル中における膜タンパク質の比較構造解析

    鈴木里佳, 吉田真帆子, 廣畑雅史, 村田武士, 小島慧一, 須藤雄気, 高橋栄夫

    Abstracts. Annual Meeting of the NMR Society of Japan   58th (CD-ROM)   2019年

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  • Effects of T686A Mutation on the Structural Stability of the AMPA Receptor Ligand-Binding Domain

    Hiraku Oshima, Suyong Re, Masayoshi Sakakura, Hideo Takahashi, Yuji Sugita

    BIOPHYSICAL JOURNAL   114 ( 3 )   125A - 125A   2018年2月

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    記述言語：英語   掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（国際会議）  

    DOI： 10.1016/j.bpj.2017.11.713

    Web of Science

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  • リン酸化によるセラミド輸送蛋白質CERTのPHドメイン機能抑制機序

    江川大地, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 熊谷圭悟, 児嶋長次郎, 児嶋長次郎, 藤原敏道, 竹内恒, 嶋田一夫, 嶋田一夫, 高橋栄夫, 高橋栄夫, 花田賢太郎

    脂質生化学研究   60   2018年

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  • NMRを用いたS-ニトロソ化によるガレクチン-2の酸化的失活防御メカニズムの解明

    坂倉 正義, 田村 真由美, 武内 智春, 荒田 洋一郎, 高橋 栄夫

    生命科学系学会合同年次大会   2017年度   [1AT26 - 09(1P   2017年12月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：生命科学系学会合同年次大会運営事務局  

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  • セラミド輸送蛋白質CERTのリン酸化による機能制御の構造生物学的解析:CERT-Golgi体の結合がCERTのリン酸化によって抑制されるメカニズムの溶液NMR法による解明

    杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 江川大地, 熊谷圭悟, 児嶋長次郎, 児嶋長次郎, 藤原敏道, 竹内恒, 嶋田一夫, 嶋田一夫, 花田賢太郎, 高橋栄夫, 高橋栄夫

    日本生化学会大会(Web)   90th   2017年

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  • セラミド輸送蛋白質CERTのPHドメイン-Golgi体間結合がCERTのリン酸化によって抑制される構造基盤:溶液NMR法による解析

    杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 杉木俊彦, 熊谷圭悟, 熊谷圭悟, 江川大地, 江川大地, 児嶋長次郎, 児嶋長次郎, 児嶋長次郎, 藤原敏道, 竹内恒, 嶋田一夫, 嶋田一夫, 花田賢太郎, 花田賢太郎, 高橋栄夫, 高橋栄夫

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   39th   2016年

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  • 若手ポスター賞Ⅰ受賞講演(JEOL RESONANCE賞) P8 MAPキナーゼp38αのストレスシグナル伝達機構の解明

    徳永 裕二, 竹内 恒, 高橋 栄夫

    NMR : bulletin of the Nuclear Magnetic Resonance Society of Japan   6   42 - 45   2015年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：日本核磁気共鳴学会  

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  • NMR法を用いたケモカインSDF‐1/CXCL12とケモカイン受容体CXCR4との相互作用様式の解明

    幸福裕, 吉浦知絵, 上田卓見, 寺沢宏明, 平井隆寛, 富永紗衣, 廣瀬雅子, 前田宜丈, 高橋栄夫, 寺島裕也, 松島綱治, 嶋田一夫

    生化学   82回   ROMBUNNO.4T4P-5 - 5   2009年9月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：(公社)日本生化学会  

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  • GPVIとコラーゲン及び結合リガンドとの相互作用解析

    小野克輝, 小野克輝, 上田寛, 吉澤良隆, 加藤こずえ, 赤澤大輔, 谷村隆次, 高橋栄夫, 嶋田一夫, 嶋田一夫

    Abstracts. Annual Meeting of the NMR Society of Japan   47th   2008年

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  • NMRによるglycoprotein VIと結合リガンドの相互作用解析

    高橋栄夫, 小野克輝, 加藤こずえ, 吉澤良隆, 赤澤大輔, 嶋田一夫, 嶋田一夫

    日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集   8th   2008年

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  • Structural and Interaction Analysis between GPVI and Its Peptide Ligands Selected from Phage Display Library

    KATO Kozue, TAKAHASHI Hideo, MIZUKOSHI Yumiko, YOSHIZAWA Yoshitaka, SUGIKI Toshihiko, AKAZAWA Daisuke, TANIMURA Ryuji, SHIMADA Ichio

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   2006   123 - 124   2007年3月

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    記述言語：英語  

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  • GPVIとコラーゲン及び結合リガンドとの相互作用解析

    小野克輝, 吉澤良隆, 加藤こずえ, 赤澤大輔, 高橋栄夫, 嶋田一夫, 嶋田一夫

    Abstracts. Annual Meeting of the NMR Society of Japan   46th   2007年

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  • ファージライブラリーを用いたGPVI結合ペプチドの探索

    加藤こずえ, 高橋栄夫, 水越弓子, 吉沢良隆, 赤沢大輔, 谷村隆次, 嶋田一夫, 嶋田一夫

    日本薬学会年会要旨集   126th ( 3 )   2006年

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  • Phage Library for Molecular Recognition Analyses by NMR (2) : Structure-based Functional Analyses of Selected Peptide

    MIZUKOSHI Yumiko, NAGASU Michiko, TAKAHASHI Hideo, SHIMADA Ichio

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   2004   153 - 156   2005年3月

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    記述言語：英語  

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  • Molecular Basis of the High-Affinity Activation of Skeletal Ryanodine Receptor Ca^<2+>-Release Channel by Imperatoxin A

    LEE Chul Won, LEE Eun Hui, TAKEUCHI Koh, TAKAHASHI Hideo, SHIMADA Ichio, SATO Kazuki, SHIN Song Yub, KIM Do Han, KIM Jae Il

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   2004   41 - 44   2005年3月

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    記述言語：英語  

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  • Phage Library for Molecular Recognition Analyses by NMR

    MIZUKOSHI Yumiko, TAKAHASHI Hideo, SHIMADA Ichio

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   2003   23 - 24   2004年3月

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    記述言語：英語  

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  • 血小板コラーゲンレセプターGlycoprotein VIのリガンド認識機構の解明

    赤沢大輔, 高橋栄夫, 嶋田一夫

    日本薬学会年会要旨集   124th ( 3 )   2004年

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  • NMRによる生体膜-ペプチド相互作用機構の解明

    中村壮史, 高橋栄夫, 竹内恒, 河野俊之, 若松馨, 嶋田一夫

    日本農芸化学会大会講演要旨集   2004   2004年

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  • 交差飽和法を用いたNMRによる蛋白質相互作用解析

    高橋 栄夫, 嶋田 一夫

    日本プロテオーム学会大会要旨集   2003 ( 0 )   39 - 39   2003年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：日本プロテオーム学会（日本ヒトプロテオーム機構）  

    DOI： 10.14889/jhupo.2003.0.39.0

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  • Solution Structure of Hanatoxin1, Gating Modifier of Drk1 Potassium Channel

    TAKAHASHI Hideo, KIM Jae Il, SATO Kazuki, SWARTZ Kenton J., SHIMADA Ichio

    Peptide science : proceedings of the ... Japanese Peptide Symposium   1999   83 - 86   2000年3月

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    記述言語：英語  

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  • 3D1130 タンパク質複合体の界面残基を同定するNMR測定法の開発

    中西 民二, 宮沢 真由美, 高橋 栄夫, 嶋田 一夫

    生物物理   40 ( 0 )   S175   2000年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人 日本生物物理学会  

    DOI： 10.2142/biophys.40.S175_1

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  • 1C1445 電位依存性Ca^<2+>チャネル Gating Modifier:ω-Grammotoxin SIAの立体構造決定

    竹内 恒, 金 載一, 高橋 栄夫, 嶋田 一夫

    生物物理   40 ( 0 )   S22   2000年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人 日本生物物理学会  

    DOI： 10.2142/biophys.40.S22_4

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  • 2PA122 NMRによるタンパク質 : タンパク質相互作用界面検出法の開発

    中西 民二, 高橋 栄夫, 中迫 雅由, 荒田 洋治, 嶋田 一夫

    生物物理   39 ( 0 )   S131   1999年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人 日本生物物理学会  

    DOI： 10.2142/biophys.39.S131_2

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  • 2PA015 NMRによるCa^<2+>チャネルアクチベーターImperatoxin Aの立体構造決定

    竹内 恒, 金 載一, 高橋 栄夫, 佐藤 一紀, 嶋田 一夫

    生物物理   39 ( 0 )   S104   1999年

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人 日本生物物理学会  

    DOI： 10.2142/biophys.39.S104_3

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  • NMRによる抗ダンシルFvフラグメントの抗原認識機構の解明

    高橋 栄夫, 増茂 正泰, 中西 民二, 進藤 一泰, 榛葉 信久, 島田 多堅, 荒田 洋治, 嶋田 一夫

    生物物理   38 ( 2 )   S6   1998年9月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人日本生物物理学会  

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  • NMRを用いた触媒抗体の構造生物学的解明

    坂倉 正義, 榛葉 信久, 高橋 栄夫, 荒田 洋治, 藤井 郁雄, 嶋田 一夫

    生物物理   38 ( 2 )   S44   1998年9月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人日本生物物理学会  

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  • NMRを用いた触媒抗体の抗原認識機構の解析

    坂倉 正義, 榛葉 信久, 高橋 栄夫, 田中 富士枝, 藤井 郁雄, 嶋田 一夫

    生物物理   37   S21   1997年10月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人日本生物物理学会  

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  • 抗ダンシル抗体における動的抗原認識機構の解析

    高橋 栄夫, 榛葉 信久, 進藤 一泰, 増茂 正泰, 荒田 洋治, 嶋田 一夫

    生物物理   37   S16   1997年10月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：一般社団法人日本生物物理学会  

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  • Role of the domain-domain interaction in the construction of the antigen combining site: A comparative study by 1H-15N shift correlation NMR spectroscopy of the Fv and Fab fragments of anti-dansyl mouse monoclonal antibody

    Hideo Takahashi, Hiroshi Tamura, Nobuhisa Shimba, Ichio Shimada, Yoji Arata

    Journal of Molecular Biology   243 ( 3 )   494 - 503   1994年10月

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    記述言語：英語   掲載種別：書評論文，書評，文献紹介等  

    DOI： 10.1006/jmbi.1994.1675

    Scopus

    PubMed

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  • 免疫学からみたCatalytic Antibody (Catalytic Antibody--触媒機能をもった抗体<特集>)

    高橋 栄夫, 荒田 洋治

    化学   45 ( 12 )   p836 - 838   1990年12月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：化学同人  

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  • 免疫グロブリンによる抗原認識の構造化学 (1989年の化学-11-)

    高橋 栄夫, 荒田 洋治

    化学   44 ( 11 )   p760 - 761   1989年11月

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    記述言語：日本語   出版者・発行元：化学同人  

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    その他リンク： http://search.jamas.or.jp/link/ui/1990117101

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共同研究・競争的資金等の研究課題

  • 光照射溶液NMR法による光駆動膜タンパク質の過渡的中間体の検出と動的構造解析

    研究課題/領域番号：23K05668  2023年4月 - 2026年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    高橋 栄夫

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    配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

    R.xylanophilus由来の光駆動プロトンポンプRxRを対象として、独自に確立した方法により調製した三重安定同位体（2H,13C,15N）標識試料を用い、基底状態におけるRxRの主鎖アミド基由来シグナルの帰属を進めた。重水素デカップリング／TROSY検出／非線形サンプリング等を組み合わせた三次元多重核共鳴測定法を活用することで、回転相関時間が30nsを超える分子量でありながら、今後のNMR解析の基盤となる主鎖アミド基由来のNMRシグナルの90%程度の帰属を完了した。帰属をもとに行った緩和分散解析およびH/D交換実験より、RxRは基底状態では剛直な構造をとると考えられた。
    次に、光反応中間体の検出に必要な光照射NMRの条件検討を行った結果、適切な光照射条件では、分光学的に同定されているO中間体が検出できることが明らかとなった。一方で光照射状態では基底状態およびその他の中間体状態との間の動的平衡状態となることで、NMRシグナルが広幅化することも判明した。この問題については、データ取得期直前で光照射を停止することで軽減されることが明らかとなったが、さらに安定に光反応中間体の解析を行うために、光反応サイクルが変調する部位特異変異体を活用することを試みた。最初の試みとして、先行研究によりM中間体の寿命が顕著に長くなることが知られているD85N変異体を用いることとした。本変異体の光照射NMR測定を実施したところ、基底状態とは全く異なる、M中間体由来と考えられる明瞭なスペクトルを得ることに成功した。
    今年度の研究の過程で、光照射NMRによる光反応中間体の検出、およびそのキャラクタリゼーションに関する論文をまとめた（Suzuki et al., JACS (2023)）。

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  • 化学シグナル伝達における分子内ネットワークの理解とアロステリック制御機構の解明

    研究課題/領域番号：20H04783  2020年4月 - 2022年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    高橋 栄夫

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    配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

    ラット由来グルタミン酸受容体AMPARのリガンド結合ドメイン（LBD）を研究対象とし、アロステリック調節薬の開発を進めるうえで重要となる分子内構造ネットワークを解明する研究を行った。具体的には、保存的変異が引き起こすLBD に誘起される微小な摂動を、高感度なメチル観測NMR法により検出することで、ネットワーク構造を解明する。昨年度までに、各保存的変異導入による化学シフト摂動を受ける領域の広がりに差が見られたことから、想定しているような構造ネットワークの存在がNMR法により検出できる可能性が示されていた。今年度は、さらに取得した変異体の化学シフト変化データを集計し、相関解析・ネットワーク解析を実施した。
    化学シフト変化値から算出された順位相関係数を用いてヒートマップを作成したところ、lobe1と呼ばれる領域に比較し、lobe2は、残基同士の相関が強いことが明らかとなった。さらにInfomap法によるコミュニティ抽出を行ったところ、7つのコミュニティが検出され、特にlobe2については、lobe1とlobe2を連結するヒンジ領域も含む、巨大な一つの構造コミュニティを形成していることが明らかとなった。
    これまでの我々の研究結果から、LBDによるリガンド認識およびその活性調節には、ヒンジ領域を介したlobeの開閉による構造平衡が関与していることが明らかとなっている。CTZなどのアロステリック調節薬は、ヒンジ領域付近に作用することが知られており、ヒンジ領域からlobe2に至る強固なネットワーク構造を介して、lobe開閉平衡を偏重させ、リガンド結合能を高めることに寄与していると考えられた。

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  • 生体発動分子の機能発現に関する構造ダイナミクス研究

    研究課題/領域番号：18H05426  2018年6月 - 2023年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    池口 満徳, 高橋 栄夫

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    配分額：93340000円 （ 直接経費：71800000円 、 間接経費：21540000円 ）

    本研究は、スーパーコンピュータ等を用いた分子動力学(MD)シミュレーションとNMR実験を活用し、理論・計測の統合によって発動分子の構造ダイナミクスと機能発現を結びつけ、新規機能獲得に向けた合理的分子設計法を確立することを目的としている。具体的な標的として、TrkAd5という生体発動分子を選択し、MD計算とNMR実験の双方からの研究を推進している。2021年度には、TrkAd5を制御する結合ペプチド（TP1）のアミノ酸置換体のデザインを行った。前年度までに実施したMD計算により推定された結合構造とNMR実験の情報に基づき、相互作用が向上すると期待されるペプチドのアミノ酸置換体を10個程度予測し、NMR実験を行った。その結果、若干ではあるがTP1より親和性が向上する置換体が見つかった。その置換体についてMD計算を実施し、その親和性向上のメカニズムを考察した。また、主要な結合要素を抽出し構造を固定化する改変体をデザインしたところ、TP1を超える結合能を示したことから、エントロピーの制御が親和性増大に有効であることが示された。
    次に、A01班と連携し、人工発動分子イオンチャネルのQM/MM-MD研究を実施した。その結果、人工発動分子イオンチャネルのフッ素原子とカリウムイオンの相互作用が、イオンチャネルの選択性に寄与しているということが明らかになった。また、B01-2班と連携し、微小管を構成するチューブリン・キネシン複合体の分子シミュレーションも継続している。また、C01班、A01班との連携研究により、好熱細菌由来ロドプシンを対象としたNMR解析を進め、9割を超える主鎖由来シグナル帰属を完了するとともに、光反応サイクルを進めるための動的構造特性について考察した。また、光照射NMR実験により、光反応後期中間体に関する構造情報の取得が可能となった。

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  • 膜環境変化に伴う膜タンパク質の機能－ダイナミクス相関の解析

    研究課題/領域番号：18H02393  2018年4月 - 2022年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    高橋 栄夫, 竹内 恒

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    配分額：17290000円 （ 直接経費：13300000円 、 間接経費：3990000円 ）

    本研究において我々は、膜内プロテアーゼを対象とした研究から、ロンボイドプロテアーゼが可溶化に用いる界面活性剤のアルキル鎖長、親水性頭部の性質により活性調節されることを示すとともに、熱安定性と酵素活性に逆相関関係が見られることを明らかにした。膜様環境の相違が分子内部運動に影響を与え、活性に影響を与えている可能性が考えられた。さらに好熱真正細菌由来微生物型ロドプシンを対象として、脂質二重膜系を含む、系統的な物性解析を行い、安定性が高い膜様環境の指標を示した。また、異なる膜様環境におけるNMR解析結果から、膜周辺環境の相違は局所構造の相違を誘起し、分子の動的構造・安定性が変調される可能性が示された。

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  • 化学シグナル伝達分子におけるアロステリック機構の動的構造基盤の解析

    研究課題/領域番号：18H04626  2018年4月 - 2020年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    高橋 栄夫

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    配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

    研究対象としているAMPA型グルタミン酸受容体リガンド結合ドメイン（AMPAR-LBD）およびその変異体を活用したNMR解析により、LBDにおける動的構造平衡のシフトが薬理活性強度を調節する鍵となることを明らかにした研究成果を論文として公表することができた。
    さらに、AMPARのアロステリック修飾薬（PAM）が、AMPARの不活性化を抑制するメカニズムを解明する目的で、LBDに対するPAM結合の影響、およびPAMの作用と類似した二量体化促進効果を有する二量体化変異体、についての解析を実施した。等温滴定型カロリメトリーによる相互作用解析を行った結果、二量体化促進に伴い、LBD と アゴニストであるグルタミン酸の相互作用が増強していることが明らかとなった。AMPAR-LBDは溶液中においては単量体で存在する一方、結晶構造としては二量体状態で解かれているものが多いが、二量体を形成してもその構造はほぼ不変であることが知られている。今回の研究から、二量体形成が促進されると静的構造は変化しないものの、リガンド結合能が増大する、すなわち不活性化の抑制を示唆する興味深い結果が得られた。次に、二量体形成に伴う不活性化抑制のメカニズムを理解する目的で、NMR解析を実施した。二量体形成したAMPAR-LBDは分子量5万を超える研究対象であるがMetメチル選択的C13標識体を活用することで、残基レベルの解析が可能となった。NMR解析より、AMPAR-LBDに対するPAMの作用、および二量体化変異体における化学シフト変化には共通したものが見られ、特にリガンド結合部位付近におけるアロステリックな構造変化を示唆する化学シフト変化が観測された。

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  • ヒト由来膜タンパク質の機能構造解明に向けたNMRアプローチ

    研究課題/領域番号：15H04340  2015年4月 - 2018年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    高橋 栄夫, 竹内 恒, 坂倉 正義

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    配分額：16250000円 （ 直接経費：12500000円 、 間接経費：3750000円 ）

    本研究において我々は、ヒト由来膜タンパク質などの高分子量タンパク質を対象とした、NMR法による機能構造解析を可能とする、酵母P. pastoris発現系を利用したメチル基選択的なラベル技術を確立することに成功した。さらに、脂質二重膜中における膜タンパク質の機能構造解析を行うために、膜タンパク質をナノリポタンパク質粒子に再構成する手法を確立し、異なる脂質中におけるヒト由来膜タンパク質の動的特性の相違をNMR法により観測することが可能となった。本研究により確立したアプローチは、NMRによるヒト膜タンパク質の機能構造解明に広く活用できるものであると考える。

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  • NMRを用いたエイコサノイド代謝関連膜タンパク質群の動的構造解析

    研究課題/領域番号：26460038  2014年4月 - 2017年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    坂倉 正義, 藤井 萌, 伏見 威俊, 小池 賢一郎, 鈴木 里佳, 高橋 栄夫

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    配分額：5070000円 （ 直接経費：3900000円 、 間接経費：1170000円 ）

    脂質に由来する生理活性物質であるエイコサノイドの代謝に関与する３個の膜タンパク質（FLAP, LTC4S, mPGES1）について、酵母を用いたリコンビナントタンパク質の発現・精製・疑似膜環境への再構成手法を確立した。得られたリコンビナントタンパク質について、NMR等の物理化学的手法を用いた性状解析・相互作用解析を行い、FLAPについては、阻害剤結合に伴い構造変化が誘起されることを見出した。本研究においては、膜タンパク質を脂質二重膜中に封入した状態でNMR解析を行う手法など、他の膜タンパク質研究に対しても応用可能な技術も開発した。

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  • 天然物リガンドの「鍵」構造を解明するハイブリッドNMRアプローチ

    研究課題/領域番号：26102735  2014年4月 - 2016年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    高橋 栄夫

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    配分額：5720000円 （ 直接経費：4400000円 、 間接経費：1320000円 ）

    野生型AMPA型グルタミン酸受容体（AMPAR）、およびそのT686A変異型は、アゴニスト結合に対するチャネル応答が異なるにも関わらず、リガンド結合ドメイン（LBD）領域のアゴニスト結合状態のX線結晶構造がほぼ同一であったため、両者の比較NMR解析を通し、リガンド薬理活性に関わる誘起構造変化の実体を明らかにすることを試みた。両LBDの均一N15標識試料を調製し、主鎖アミド基由来シグナルの帰属を行い、活性の異なる2種類の完全アゴニスト（グルタミン酸およびキスカル酸）結合時のNMRシグナル変化を解析したところ、AMPAR-LBDを構成する2個のサブドメインの界面残基が、活性変化と対応して化学シフト変化を示すことが明らかとなった。部分アゴニスト結合状態のNMRスペクトルとの比較も行った結果、アゴニスト結合状態のAMPAR-LBDは、2個のサブドメインが閉じた状態とわずかに開いた状態の平衡状態として存在することが示唆され、これらの状態間の存在比の変化が活性の変化を生むと推察された。このような活性変化とリンクしたサブドメイン間のダイナミクスを定量的に評価することを目的として、H/D交換速度解析（分～時間領域）、N15横緩和解析（ミリ秒領域）の運動性の解析を行った。この結果、ミリ秒、および分～時間の時間領域の運動性は、活性変化と相関しないことが示されたことから、より速い時間域での構造平衡が存在することが示唆された。

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  • ヒト由来膜タンパク質のＮＭＲ構造解析に向けた基盤研究

    研究課題/領域番号：24370048  2012年4月 - 2015年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    高橋 栄夫, 竹内 恒, 坂倉 正義

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    配分額：17810000円 （ 直接経費：13700000円 、 間接経費：4110000円 ）

    酵母発現系を用いることで、大腸菌発現系では調製することが困難なヒト由来膜タンパク質について、NMRを用いた構造解析を行うための試料調製手法の開拓を行った。この結果、複数のヒト膜タンパク質を酵母の細胞膜中に発現させることに成功するとともに、様々なバリエーションの安定同位体ラベル手法を確立し、NMRを用いた膜タンパク質の構造解析に利用できることを示した。本研究により確立した酵母を用いた膜タンパク質の安定同位体ラベル手法は、様々な膜タンパク質に対して応用可能であり、汎用性が高いと考える。

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  • 天然物リガンドの「鍵」構造を解明するＮＭＲ手法の高度化

    研究課題/領域番号：24102524  2012年4月 - 2014年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    高橋 栄夫

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    配分額：6760000円 （ 直接経費：5200000円 、 間接経費：1560000円 ）

    本年度は、昨年度までに開発・高度化を進めたエピトープマッピング法の高分子量疾患関連タンパク質－リガンド相互作用系への適用を進めた。当初研究対象として考えていた中枢神経系抑制性シナプス受容体であるGABA受容体細胞ドメインαサブユニットについては、その発現・精製に成功し、ベンゾジアゼピン系化合物の結合活性がSTD法により確認されたが、試料に顕著な凝集性が見られたため、新たに好熱古細菌由来のプロテアソームαサブユニット七量体（α7）発現系を構築し、α7を標的としたリガンドエピトープ解析を実施することとした。リガンドとしては、従来のプロテアソーム阻害剤と異なるメカニズムで作用することが近年明らかとなったが、そのリガンドエピトープは不明であるクロロキンを選択した。高分子量標的タンパク質であるα7において精度良くリガンドエピトープマッピング実験を行うために、各種条件（タンパク質濃度、タンパク質－リガンド濃度比、等）の検討を進めた結果、α7に結合したクロロキンのリガンドエピトープ（芳香環H1～H3, メチルH7）を同定することができた。
    さらに昨年度考案した部位特異的なエピトープマッピング実験の本相互作用系への適用を試みた。重水素化したα7を調製しエピトープマッピング実験を行った場合には、タンパク質選択的照射による縦緩和速度差はほとんど現れなかったのに対し、イソロイシン選択的にプロトン化したα7を用いた解析では、クロロキンの芳香族プロトン（H1, H3）に大きな縦緩和速度差が観測された。これにより、α7のイソロイシン残基近傍にクロロキン芳香環の一部が存在していることが示唆された。この情報はα7のクロロキン結合部位の同定およびリガンド配向様式の決定につながる有用なものであるが、精度良い結合部位同定を行うためには、他の数種類のアミノ酸選択的プロトン標識体を調製しエピトープマッピング実験を行っていく必要がある。

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  • ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼのリガンド認識機構の解明と創薬に向けた分子基盤

    研究課題/領域番号：23570146  2011年4月 - 2015年3月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    永田 崇, 高橋 栄夫

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    配分額：5590000円 （ 直接経費：4300000円 、 間接経費：1290000円 ）

    TAM受容体チロシンキナーゼは多様な細胞機能と疾患に関わっている。そのうちTyro3とMerについて、糖鎖修飾が施される酵母K.lactisを用いた各種試料調製方法、安定同位体標識化方法、糖鎖修飾の分析方法、相互作用解析法、各種NMR法の整備を行った。さらに、これらの方法を用いてTyro3とMerについて糖鎖修飾が構造と機能に与える影響を調べた。また、標的タンパク質に対して強く結合する分子の取得及び評価を行うための手段も得た。本研究成果をもとに、今後はTAM受容体の機能発現について立体構造ベースの知見と、TAM受容体とリガンドまたは薬剤候補分子の分子認識機構の解明に向けた研究を展開させていく。

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  • 生命システム解明を目指したNMRによる生体分子間相互作用解析法の開発

    研究課題/領域番号：14011262  2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究

    高橋 栄夫

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    配分額：4900000円 （ 直接経費：4900000円 ）

    研究代表者らが開発した交差飽和法は、タンパク質複合体の相互作用界面を、これまでにない精度で決定することが可能な手法であるが、その適用にあたっては、高分子量蛋白質複合体におけるスピン拡散を抑制するために、リガンド蛋白質を高度に重水素化することがポイントとなる。しかしながら、これは測定感度の低下を引き起こすことになり、網羅的な相互作用解析に適しているとはいい難かった。本研究では、側鎖メチルプロトンを利用することで、交差飽和法における問題点を克服することを試みた。
    はじめに、交差飽和実験の計算プログラムを作成し、メチル基の交差飽和実験のシミュレーションを行った。その結果、メチル基特有の回転運動に起因するメチルプロトンのT1が短いという特徴により、交差飽和実験結果に悪影響を与える分子内スピン拡散効果は軽減されることが明らかとなった。実験のモデル系としては、複合体分子量164KのFB-マウスIgG1の系を利用した。メチル基選択的な安定同位体標識は、Kayらにより提案されているILV標識法で行った。照射領域の検討を行い、250ミリ秒の短い照射時間でも相互作用界面に存在するメチルプロトンに、交差飽和による顕著な強度減少が見られたことから、分子間飽和移動の効率は極めて高いことが明らかとなった。さらに、メチルプロトンの短いT1により、繰り返し時間を短縮することが可能であり、アミドプロトン検出(90%重水溶媒条件)の場合に比べ、圧倒的に検出感度は高くなった。特に高分子量蛋白質において、メチルプロトン検出は、TROSYを利用したアミドプロトン検出以上に感度が良いことが知られていることから、本法は高分子量蛋白質複合体の相互作用残基の決定において極めて有効な方法になると考えられる。

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  • NMRを用いた紫外線損傷DNAの構造生物学的解析

    研究課題/領域番号：13214024  2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(C)

    嶋田 一夫, 高橋 栄夫

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    配分額：4400000円 （ 直接経費：4400000円 ）

    T. Thermophilus HB27由来CPD photol yaseを大腸菌により大量発現させた。
    Polyethyleneimine、P11 column、DNA-cellurose column、DEAE Sephadex A-25 columnによってSDS-PAGEで単一のバンドとして観測されるまで精製した。得られたphotolyaseとCPDを含む一本鎖DNAヘプタマー(ss7mer CPD)を混合し、370nmの光を照射することにより、CPDが修復ざれることを確認した。バッファー中の還元剤(sodium ditionite、Na2S204)め量を調節することにより、photolyaseの酸化還元状態を還元型およびラジカル型に統一した。基質DNAとしては、紫外線照射によりCPDを生じたDNAオリゴマーを、逆相HPLCで精製して用いた。以上のphotlyaseと損傷DNAをNMR解析に供した。まず、photolyaseの補酵素FADの酸化還元状態の変化に伴う、ポリペプチド鎖およびFADに由来するシグナルの強度変化を調べた。FADに関しては、他のシグナルと分離して観測することが可能であるリン原子を観測対象とした。還元型およびラジカル型CPD photolyaseの31P NMRスペクトルを測定した結果、ラジカル型ではFADの2個のリン酸に由来するシグナルのうち1つが消失した。一方、ポリペプチド鎖に関しては光反応の際に電子伝達の経路となる可能性が示峻されているトリプトファン残基を観測対象とした。ラジカル型ではTrP24β、Trp352を含む3残基に由来するシグナルが消失した。したがって、FADラジカルの影響によりFAD近傍にある原子を同定することが可能となった。

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  • 生命システム解明を目指したNMRによる生体分子間相互作用解析法の開発

    研究課題/領域番号：13202018  2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(C)

    高橋 栄夫

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    配分額：5900000円 （ 直接経費：5900000円 ）

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  • 原子レベルでの病態解明に向けたハイスループットなタンパク質相互作用解析法の開発

    研究課題/領域番号：13204018  2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(C)

    嶋田 一夫, 高橋 栄夫

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    配分額：5200000円 （ 直接経費：5200000円 ）

    ヒトゲノムのDNAマップ作成がほぼ終わりに近づいているが、同定された遺伝子をさらに有効活用していくためには、個々の遺伝子の機能を解明し、実際の病態や薬剤応答性について分子と分子の相互作用レベルでの理解が必須である。本研究ではハイスループットかつ分子間相互作用様式を明らかにするNMR測定システムの確立を目指した。申請者の開発したNMRを用いた交差飽和法によるタンパク質複合体相互作用界面決定法は、複合体のNMRシグナルの観測を行うため、現実的な適用限界はタンパク質複合体の分子量が5万程度のものまでに限られていた。この場合、創薬のターゲットとなる可能性の高い膜タンパク質などの高分子量タンパク質複合体には適用が困難であった。そこで、より高分子量の標的タンパク質複合体に対し適用可能な方法の開拓を行った。交差飽和法の拡張バージョンとして、交換系を用いた「転移交差飽和法」の開発を行った。この手法では界面を同定したい蛋白質(リガンド蛋白質)を標的蛋白質に比べ、過剰に加え、リガンド蛋白質の標的蛋白質に対する結合状態および非結合状態か混在するようにする。ここで、2種の状態が互いに適度な速さで交換している場合、結合状態で生じた交差飽和法の影響を非結合状態を通して観測することかできる。したがって、結合状態の分子量はNMR測定の制限とはならない。実際、抗体結合性蛋白質(6K)と抗体(150K)の系にたいして、転移交差飽和法を試したところ、リカント蛋白質側の界面残基の同定に成功した。したがって、150K以上の蛋白質複合体の界面残基同定法が確立できた。

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  • イオンチャネルのゲーティング機構阻害ペプチドにおける構造活性相関の研究

    研究課題/領域番号：12771376  2000年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  奨励研究(A)

    高橋 栄夫

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    配分額：2100000円 （ 直接経費：2100000円 ）

    (1)カリウムチャネルゲーティング機構阻害ペプチドhanatoxin1とカルシウムチャネルゲーティング機構阻害ペプチドgrammotoxinの化学合成を行った.特に,hanatoxin1に関しては,これまで大量合成法が知られておらず,種々の条件検討を行った結果,最終的に数mgの合成品を得ることに成功した.得られた合成hanatoxin1,grammotoxinについて,電気生理学的手法により天然のものと同程度の活性があることを確認した.
    (2)化学合成したhanatoxin1とgrammotoxinについて,NMR法による水溶液中立体構造解析を行った.NMR解析の結果,両ペプチドともに500個を超える距離・二面角拘束条件が得られた.それらの情報をもとに構造計算を行った結果,主鎖のrmsdが0.3Å以下の高精度の水溶液中立体構造を決定することができた.
    (3)Hanatoxin1とgrammotoxinの立体構造を比較したところ,両者は同様のジスルフィド結合トポロジーを有するとともに,大きな疎水性パッチをを取り囲むように塩基性アミノ酸残基が存在するという共通点があることが明らかとなった.ナトリウムチャネルのゲーティング機構阻害ペプチドの立体構造と比較してみたところ,この特徴は,ゲーティング機構阻害ペプチドに共通してみられる構造モチーフであることが示唆された.ゲーティング機構阻害ペプチドは,この構造的特徴により,相補的な特徴を有するイオンチャネルのS3-S4リンカー領域に結合することが可能となり,チャネルのゲーティング機構を阻害すると考えられる.

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  • 触媒抗体の触媒機能発現メカニズムの解明と活性向上を目指した改変

    研究課題/領域番号：12019209  2000年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(A)

    嶋田 一夫, 高橋 栄夫

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    配分額：2000000円 （ 直接経費：2000000円 ）

    本研究ではクロラムフェニコール・リン酸エステル誘導体を抗原として得られたエステル加水分解を触媒する数種類の抗体(生物分子工研・藤井博士により供与された)を解析の対象とした.その中で触媒抗体6D9および7C8を研究対象として取り上げ、その触媒活性発現機構を構造生物学的見地より明らかにする目的で以下の研究を進めた.
    1)TRNOE法により,触媒抗体に結合した基質,および遷移状態アナログの構造決定を行う.
    2)安定同位体利用NMR法により,遷移状態アナログおよび基質結合状態における,触媒抗体反応部位のアミノ酸残基の存在様式を解明する.
    TRNOE解析の結果から,触媒抗体6D9のエステル結合は不安定なシス型に偏ったコンフォメーションをとり、基底状態の基質を不安定化させている可能性が示唆された.7C8の触媒部位にはHis残基が存在し、その化学状態(プロトネーション状態)が活性発現に重要であることが明らかになった。

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  • イオンチャネルブロッカーの構造生物学的研究と創薬への展開

    研究課題/領域番号：11307053  1999年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(A)

    嶋田 一夫, 加藤 晃一, 高橋 栄夫

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    配分額：39650000円 （ 直接経費：37100000円 、 間接経費：2550000円 ）

    GrTxは、Xenopus oocytesから発見された、アミノ酸残基36残基からなるチャネル阻害剤である。チャネル阻害剤は、ボアー阻害剤とゲーティング変調剤に分けられる。ボアー阻害剤は、チャネル孔に結合しイオンの透過を妨げると考えられ、ゲーティング変調剤は、チャネルの開閉を制御するゲーティング領域に作用し、結果としてイオンの透過を妨げる。GrTxは、その機能から後者に分類される。
    本年度は、GrTxの溶液における立体構造を核磁気共鳴(NMR)法により決定した。まず、GrTxを固相重合法により化学合成した。合成したGrTxは電気生理的にその活性が充分であることを確認した後、NMR測定に供した。各種2次元NMR測定を行い、スペクトル解析し、NOEから構造計算のための距離制限を集めた。得られた、距離制限に基づき分子動力学計算を行い、GrTxの立体構造を求めた。
    GrTxは、2個のβ鎖と1個のβバルジからなる、所謂、'inhibitor cystine knot'を持つことが判明した。そして、その表面構造は、先の研究より明らかになった、ゲーティング変調剤HaTxの表面に存在したゲーティング変調剤の特徴と一致した。したがって、GrTxのチャネルの相互作用には、HaTxと同じ荷電残基に囲まれた疎水パッチが重要であることが明らかになった。
    さらに、表面の形、荷電残基の分布を調べたところ、HaTxと似ているものの違いが見られた。HaTxとGrTxはそれぞれ、KチャネルおよびCaチャネルに強く結合する。しかし、親和性こそ弱いものの、HaTxはCaチャネルに、GrTxはKチャネルに結合する。したがって、この反応交差性は、表面状態の微妙な違いに由来すると考えた。

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  • がん診断治療を目指した免疫グロブリンFvフラグメントの構造生物学的研究

    研究課題/領域番号：11140220  1999年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(A)

    嶋田 一夫, 高橋 栄夫

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    配分額：1600000円 （ 直接経費：1600000円 ）

    我々は抗体産生細胞1B10.7の産生する抗体を酵素消化することにより抗原認識最小単位である抗DNS Fvフラグメントの作成に成功し,さらに,そのFvが他のFvに比べ高い安定性を有することを示した.したがって,抗DNS Fvに対して,遺伝子工学的にそのCDR領域の変換(CDR grafting)を施せば,安定でかつ,がん診断・治療等に有用な抗体フラグメントを得ることが可能となる.そこで本研究では,抗DNS Fvの安定化機構の解明を行った.まず,均一安定同位体(^<13>C and/or ^<15>N)標識抗DNS Fvを作成するとともに,多くのアミノ酸選択的安定同位体標識Fvアナログを作成し,NMR解析を行うことで,その主鎖アミド基由来のNMRシグナルの99%について帰属を完了した.帰属されたシグナルを利用し,NMR法により様々な動的構造の解析を行うことで,抗DNS Fv分子を構成するV_H,V_Lの2つのドメインは,その動的特性に顕著な違いが見られることが明らかとなった.さらにこの相違が分子内部のドメイン界面に存在するアミノ酸残基の疎水性度合(hydropathy)によく対応していることが判明した.また,ハプテンであるDNS-Lysを添加することで,Fv分子の安定性が著しく増大することも示された.これらの結果は,安定なFv分子の作成のための重要な指針になると考えられる.

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  • 触媒抗体の触媒機能発現メカニズムの解明と活性向上を目指した改変

    研究課題/領域番号：11132206  1999年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(A)

    嶋田 一夫, 高橋 栄夫

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    配分額：1900000円 （ 直接経費：1900000円 ）

    触媒抗体7C8は,触媒抗体6D9と同じエステル加水分解反応を触媒することが知られている.しかしながら,その触媒メカニズムは6D9とは異なり,単なる遷移状態の安定化以外の因子が重要であることが指摘されている.反応速度に関して,6D9抗体では,pH変化に伴う速度変化が線形であることが特徴であるのに対し,7C8では中性付近ではpHで対し線形であるがpH9付近でプラトーに達するprofileとなる.これは,pH9付近にpKaをもつ解離性アミノ酸残基が触媒反応に関与していることを示しており,X線結晶構造解析から,これはTyr95(H)であると考えられている.今回,より広いpH領域における反応速度依存性を調べたところ,さらにpH4.5付近に変曲点があることが明らかとなった.そこで,7C8の触媒反応進行要因を探るため,NMRにより7C8の反応部位のミクロ環境の解析を行った.エステル中心の炭素を^<13>Cで標識した反応基質を作成し,7C8結合時における^<13>C化学シフトのpH滴定実験を行った.その結果,pKaが4.6を有する解離性アミノ酸残基が,反応部位に影響を与えていることが明らかとなった.一方,各種アミノ酸選択的安定同位体(^<15>N,^<13>C)標識7C8アナログを用いた解析により,pKaが4〜5を有するアミノ酸はHis92(L)であると考えられた.これらの事実は,抗体7C8による触媒反応がTyr95(H)とHis92(L)の解離性アミノ酸残基の相乗的な作用により推進されている事を意味する.現在,これらのアミノ酸残基が関与した反応機構を明らかにするため,反応中間体のリアルタイム検出を行っている.
    また,6D9,7C8の触媒機能の改変,および新規高活性触媒抗体の作成を目指した,大腸菌によるFv発現系の構築を行っており,現在,発現ベクターの作成が完了したところである.

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  • NMR法による触媒抗体の構造特性の解析と触媒能の改変

    研究課題/領域番号：10672018  1998年 - 1999年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    高橋 栄夫

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    配分額：3200000円 （ 直接経費：3200000円 ）

    アミノ酸配列の相同性は高いが,エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10について安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.新規に開発したNMR測定法により,基質およびTSA結合における,ヒスチジン側鎖のプロトン解離状態,および互変異性体の決定などを行ったところ,His27d(L)がTSA結合時にTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合を形成していることが明らかとなった.さらに,基質およびTSAに存在する2つの芳香環について,高活性6D9抗体は両芳香環の相対位置を厳密に認識するが,低活性の9C10抗体は一方の芳香環の認識が甘いことが判明した.
    一方,触媒抗体7C8は,単なる四面体型中間体の安定化以外の因子が重要であることが指摘されている.今回中性〜酸性領域における反応速度のpH依存性を調べたところ,pH4.5付近に変曲点が存在した.また,7C8結合時における,エステル中心の炭素の化学シフトのpH依存性を調べたところ,pKaが4.6を有する解離性アミノ酸残基が反応部位に影響を与えていることが明らかとなった.7C8の安定同位体標識を行いpH滴定実験などにより,相当する7C8の解離性アミノ酸残基を調べたところ,His92(L)のpKaが5以下であり,触媒反応速度に影響を与えるアミノ酸残基であることが判明した.現在His92(L)の関与する反応機構を明らかにするため,低温での反応中間体検出実験を進行中である.
    これまでに得られた構造生物学的知見をもとに,反応機構の異なる高活性触媒抗体6D9,7C8の触媒能のさらなる向上,および両者の特長を生かした,ハイブリッド触媒抗体の作製を目指し,大腸菌によるFv発現系の構築を計画した.現在6D9-Fvについては可溶画分における発現が可能となり,精製条件の検討を行った結果,純度の高いFvを得ることが可能となった.

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  • 触媒抗体の触媒機能発見メカニズムの解明と活性向上を目指した改変

    研究課題/領域番号：10145206  1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(A)

    高橋 栄夫

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    配分額：1800000円 （ 直接経費：1800000円 ）

    エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10を研究対象とし、それらの安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.両抗体は反応速度解析の結果から、基質と遷移状態アナログ(TSA)に対する親和力の差が触媒活性を生み出す機構であることがわかっている.NMRより得られた構造情報を比較・解析することにより,触媒反応に必要な抗原結合部位の特性について考察した.
    1)6D9の触媒活性発現に重要な残基であるHis27d(L)の側鎖NHのNMRシグナルを解析したところ,His27d(L)とTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合が形成されていることが判明した.6D9と基質との結合,および9C10における基質・TSA結合の際は、水素結合の形成は観測されなかった.したがって、6D9では,基質とTSAのエステル部分の化学構造の識別にHiS27d(L)が、水素結合を通して主要な役割を果たしていると考えた.
    2)基質とTSAはともに2個の芳香環を有するもののエステル部分の原子軌道は,それぞれsp2およびsp3と異なる.したがって、抗体に結合した状態では,基質とTSAでは反応中心を挟んだ2個の芳香環の相対配置が異なる立体構造をとる.NMR解析の結果,9C10結合状態では、TSAの4-((trifluoroacetyl)amino)phenyl)環の回転運動が抑制されるのに対し,nitorophenyl環の回転運動は抑制されていなかった.一方6D9においては、TSAの2個の芳香環の回転運動がともに抑制され,抗原認識において両芳香環がともに重要な役割を果たすことが明らかになった.これらの知見より、両芳香環をともに認識する6D9では,基質とTSAの立体構造の差を鋭敏に識別することにより親和力の差を生み出し,その結果,高い酵素活性を発揮すると考えた.

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  • NMRを用いたタンパク質分子に内在するダイナミックスと機能発現の研究

    研究課題/領域番号：10157204  1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究(A)

    高橋 栄夫

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    配分額：1300000円 （ 直接経費：1300000円 ）

    我々は抗ダンシル抗体を酵素消化することにより得られるFvフラグメントを用いて,抗原認識機構の高次構造解析を行ってきた.昨年までのNMR,および速度論的手法を中心とする解析により,抗ダンシルFvの抗原結合部位を形成しているH3ループは,ハプテン非存在下において2種類のコンホメーションをとり,16(s^<-1>)の平均交換速度で移り変わっているが,ハプテン存在下では1種類のコンホメーションに収束することを明らかにしてきた.本年度は,抗原結合部位の示す動的構造と機能の相関について,より深い理解を得るために,抗ダンシルFvの大腸菌発現系の構築・部位特異変異体の作成を行い,それらの安定同位体標識NMRおよび蛍光測定法による解析を進めた.
    抗ダンシル抗体産生ハイブリドーマからRT-PCR法によりV_H,V_Lドメインをそれぞれコードする遺伝子を合成した.その遺伝子を個別に発現用ベクターに組み込み大腸菌発現系を構築し,V_H,V_Lを封入体として得た.次いでこれらの封入体蛋白質を変性剤存在下で等量混合し,段階的に変性剤濃度を低下させることにより,Fvを再構成した.その結果,V_H,V_Lドメイン各々1Lの培養から約3mgのへテロダイマーFvが得られた.また,ハプテンの認識に主要な役割を果たすH3ループに存在するTyr残基の部位特異変異体を作成した.
    蛍光測定により,得られたリコンビナントFv(WT)は,酵素消化により得られたFvと同様の結合能を有することが判明した.また,H鎖Y96F変異体(Y96F)の結合定数は,WTと比較し1/5に低下していた.Y96FのNMR解析の結果,WTで観測されていた2種類のコンホメーションに対応するNMRシグナルが,Y96Fでは観測されなかった.したがって,Tyr96の両親媒性が,抗原結合部位に存在する構造多形現象および結合能に関与していることが示唆された.

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  • NMRを用いたタンパク質分子に内在するダイナミックスと機能発現の研究

    研究課題/領域番号：09261203  1997年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  重点領域研究

    高橋 栄夫

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    配分額：1900000円 （ 直接経費：1900000円 ）

    免疫グロブリンは未知の外来異物に対し,ループ構造よりなる6ヶ所の相補性決定領域(CDR)を用いた特異的な分子認識を行う.本研究では,抗ダンシル抗体(Fv)を題材とし,抗原結合ループのもつダイナミックスを定量的に捉え,抗原結合部位におけるダイナミックスが分子認識に及ぼす影響について解析を行った.抗ダンシルFvの調製に関してはすでに当研究室で確立しているミュータント抗体の酵素消化法により行った.抗原結合部位に多く存在するといわれている,Tyr残基の選択的・高感度なNMR測定を行うために,Tyr残基の3,5位芳香環プロトン以外の芳香族アミノ酸残基を重水素標識したFvを調製したところ,抗原結合部位H3ループに存在する残基のNMRシグナルが,抗原非存在下において2つずつ観測されたことから,抗原結合部位が動的な構造多形をとっていることが明らかとなった.ハプテン結合実験の結果,ハプテンの認識にはH3ループに存在する2つのコンホメーションのうち一方が関与していることが判明した.この抗原結合部位に存在するダイナミックな構造多形の現象がFvとハプテンの複合体形成過程にどのような影響を与えるかを解析するために,ストップトフロー蛍光測定を行った.その結果,Fvとダンシルリジンの複合体形成過程は二相性を示し,その濃度依存性の解析から抗原非存在下におけるコンホメーション平衡の交換速度を算出するとNMRによって得られた値と一致した.以上より,抗ダンシル抗体のハプテン認識過程にH3ループに存在するダイナミックスが影響を与えている事実が明らかとなった.抗原結合部位のもつ動的構造多形は決して稀な現象ではなく,他の抗原に特異性を有する抗体分子についても多く見られている.このような動的構造多形現象は,一次配列の多様性に加え,高次構造的多様性を産み出す機構として抗原認識において重要であることが予想される.

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  • 免疫応答におけるマチュレーション機構の解明

    研究課題/領域番号：07407062  1995年 - 1997年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(A)

    高橋 栄夫, 嶋田 一夫, 西村 千秋, 加藤 晃一

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    配分額：39600000円 （ 直接経費：39600000円 ）

    免疫経過に伴う親和力マチュレーションの過程で得られる一連の抗NP((4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニル)-アセチル)抗体群を題材とし,抗体が抗原への親和性・特異性を獲得していく高次構造的背景を理解する目的で実験を行った.
    免疫過程の各段階で得られた抗原群に対し,ストップトフロー蛍光法による速度論解析を行ったところ,抗NP抗体の親和力マチュレーションにおいて頻繁に見られる,H鎖Trp33→Leu置換による親和力の上昇は主に結合速度定数(kon)の増大に起因していることが明らかとなった.この親和力増大の機構を高次構造の観点から明らかにするために,抗原結合部位に多く存在するTyr,Trp残基をプローブとした安定同位体利用NMR解析を行った.帰属されたNMRシグナルをもとに抗原結合部位の構造解析を行った結果,以下の高次構造情報が得られた.
    1.スピンラベル化NPハプテンを利用し,抗原結合部位を同定した結果,初期抗体N1G9とH鎖Trp33→Leu置換型後期抗体B2の抗原結合部位は同一であることが明らかとなった。
    2.緩和時間測定,およびアミド水素交換速度の測定を行った結果,後期抗体B2の抗原結合部位には初期抗体N1G9にはみられない動的構造多形が存在すること,すなわち柔軟性が高いことが判明した.
    得られた結果を総合すると,抗NP抗体におけるH鎖Trp33→Leu置換による親和力マチュレーションは,抗原非存在下における抗原結合部位に運動性を与えることで,抗原結合過程を改善させるものであると考えられる.このタイプのマチュレーション機構は非常に効率的であるために抗NP抗体のマチュレーションにおいて頻繁に見られると考えられる.このような抗体分子が抗原に対し,より高い親和力を獲得していく機構を考察することは,リガンド認識能の改変を目指すタンパク質工学において新たな指針を与えると考えられる.

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